Puce à ADN

Principe d'utilisation de la puce à ADN.

Une puce à ADN est un ensemble de molécules d' ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d' expression des gènes ( transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.

Les puces à ADN sont aussi appelées puces à gènes, biopuces ou par les termes anglais « DNA chip, DNA-microarray, biochip ». Les termes français microréseau d'ADN et micromatrice d'ADN sont aussi des termes proposés par l' Office québécois de la langue française [1].

Le principe de la puce à ADN repose sur la propriété que possède l'ADN dénaturé (simple brin) de reformer spontanément sa double hélice lorsqu'il est en présence d'un brin complémentaire ( réaction d'hybridation). Les quatre bases nucléiques de l'ADN ( A, G, C, T) ont en effet la particularité de s'apparier deux à deux par des liaisons hydrogène (A = T et T = A ; G ≡ C et C ≡ G).

On parle de sonde (fragment d'ADN synthétique représentatif des gènes dont on cherche à étudier l'expression, fixé de façon covalente à la surface de la biopuce) et de cible (ARNm que l’on cherche à identifier et/ou à quantifier (échantillon)). Les cibles sont marquées par fluorescence (voir plus bas).

Les puces à ADN peuvent être utilisées pour mesurer/détecter les ARN qui seront ou pas traduits en protéines. Les scientifiques parlent d'analyse d'expression ou de profil d'expression. Puisqu'il est possible de fixer jusqu'à un million de sondes sur une biopuce, les puces à ADN constituent ainsi une approche massive et ont contribué à la révolution de la génomique [2], puisqu'elles permettent en une seule expérience d'avoir une estimation sur l'expression de plusieurs dizaines de milliers de gènes. Mais il existe également un grand nombre d'applications différentes qui font intervenir la technologie des puces à ADN (criblage de mutations, reséquençage, interactions ADN/protéine, écologie microbienne).

Principe

En pratique, les ARN totaux sont extraits des cellules étudiées et subissent parfois une amplification qui va permettre d'obtenir une quantité de matériel génétique suffisante pour l'expérience. Ces ARNm sont ensuite transformés en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de rétrotranscription et marqués. Ce marquage est aujourd'hui assuré par une molécule fluorescente ( fluorochrome). Il existe deux fluorochromes majoritairement utilisés : la Cyanine 3 (Cy3) qui fluoresce dans le vert et la Cyanine 5 (Cy5) qui fluoresce dans le rouge. Les cibles ainsi marquées (ADNc) sont ensuite mises en contact avec la puce (portant l'ensemble des sondes à sa surface), cette étape est nommée hybridation. Chaque brin d'ADNc va alors s'hybrider aux sondes qui lui sont complémentaires pour former un duplex sonde/cible double brin. La biopuce est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d' ADNc ne s'étant pas hybridés car non complémentaires des sondes fixées sur la lame. La biopuce va ensuite être analysée par un scanner à très haute résolution, et ce à la longueur d'onde d'excitation de la Cyanine 3 ou de la Cyanine 5. L'image scannée est alors analysée informatiquement afin d'associer une valeur d'intensité à chaque sonde fixée sur la biopuce et ainsi de déterminer s'il y a eu une hybridation pour chaque sonde.

 Les étapes d'une expérience de biopuce ADN
Les étapes d'une expérience de biopuce ADN

Lors d'une expérience de biopuce ADN visant à comparer l'expression des gènes entre deux conditions (par exemple : cellule saine versus cellule malade), les ARN totaux des deux populations de cellules sont extraits et marqués chacun avec un fluorochrome différent. Les deux échantillons sont alors déposés simultanément sur la biopuce, on parle d'hybridation compétitive. Pour un gène donné, si le nombre de molécules d'ADNc correspondant à ce gène est plus important dans une condition que dans l'autre, l'hybridation entre ces ADNc et les sondes associées sera favorisée. Ainsi, après avoir scanné la biopuce aux deux longueurs des deux fluorochromes utilisés, il est possible de comparer l'intensité du signal vert du signal rouge et donc de savoir pour chaque gène étudié dans quelle condition est-il le plus exprimé.

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