Microscopie à fluorescence

La microscopie en fluorescence (ou en épifluorescence) est une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence et de phosphorescence, au lieu de, ou en plus de l'observation classique par réflexion ou absorption de la lumière visible naturelle ou artificielle [1], [2].
On peut ainsi observer divers objets, substances (organiques ou inorganiques) ou échantillons d'organismes morts ou vivants.

Microscope à fluorescence verticale (Olympus BX61), équipé de filtres et d'un appareil photo numérique.
Microscope à fluorescence inversé (Nikon TE2000) ; la plaque orangée permet à l'utilisateur de regarder l'échantillon, tout en protégeant les yeux de la lumière UV qui excite la cible pour la rendre fluorescente.
Principe de fonctionnement du microscope à fluorescence puis du microscope confocal.

Elle fait désormais partie des méthodes de recherche classiques et de la biologie et continue à se développer avec l' imagerie moléculaire.

Principes

La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise. Le déplacement de Stokes décrit la différence entre la longueur d'onde absorbée par l'objet (émise par la source lumineuse du microscope) et émise par l'objet. Plus la différence entre les deux longueurs d'onde est grande plus il est facile d'observer la fluorescence.

Article détaillé : fluorescence.

Fluorescences primaire et secondaire

En fluorescence on distingue deux types d'objets :

  • les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes [3], on parle de « fluorescence primaire » ou autofluorescence ( chlorophylle, huile...),
  • les autres doivent être combinés à une substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de « fluorescence secondaire » [3].

En microscopie de fluorescence, on peut donc visualiser directement des substances fluorescentes. Pour des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes, il est nécessaire de les marquer par des substances appelées fluorochromes, comme le DAPI qui marque l' ADN et fluoresce en bleu.

Certains marqueurs génétiques comme la protéine fluorescente verte, (en anglais Green Fluorescent Protein ou GFP) sont aussi très utilisés en biologie dans des organismes génétiquement modifiés pour en produire de manière endogène. Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et ne nécessite pas l'ajout de substrat. La fluorescence peut alors être visualisée directement dans les cellules vivantes, c'est un des domaines développés par l' imagerie moléculaire.

Les techniques de marquage

De nombreuses techniques de marquage peuvent être utilisées :

  • Le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer.
  • L'immunomarquage direct ou indirect fait intervenir un anticorps marqué.
  • La technique du FISH sert à marquer des séquences nucléotidiques.
  • L'utilisation de protéines de fusion (typiquement, la GFP) consiste à introduire dans la cellule à observer un gène de protéine recombinante fluorescente (par transfection ou infection), la protéine synthétisée est alors fluorescente.
  • Le FLIP et le FRAP consistent à irradier une zone dont la fluorescence va disparaître. Ces techniques permettent d'étudier la diffusion des molécules marquées, en effet si des molécules se déplacent la fluorescence se répartira.
  • Le FRET utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules.
  • le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), comme le FRET sinon que le donneur est bioluminescent ( luciférase).

Excitation monophotonique

On peut exciter les substances fluorescentes par une excitation monophotonique. On utilise pour cela une lumière d'excitation dont la longueur d'onde excite directement le fluorophore. Donc, la fluorescence émise peut provenir de toute l'épaisseur de l'échantillon traversée par le faisceau d'excitation. L'élément clé de ce microscope confocal est alors représenté par une "fenêtre" (un sténopé ou un iris confocal) placée devant le détecteur qui élimine la fluorescence provenant des régions non focales. L'observation de signaux de fluorescences repose sur cinq éléments :

  • une source de lumière pour l'excitation,
  • un fluorophore,
  • des filtres pour séparer les photons d'émission des photons d'excitation,
  • un sténopé,
  • un détecteur pour transformer le signal lumineux des photons en signal électrique.

Excitation multiphotonique

Cette excitation consiste en l'absorption quasi simultanée de plusieurs photons d'excitation d'une longueur d'onde proche d'un multiple de l'excitation optimale à un photon. On utilise pour cela un laser pulsé dans des fréquences proches de l'infrarouge. Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation). Bien souvent les applications sont limitées à la microscopie biphotonique (excitation du fluorophore par deux photons).

Ce système est considéré comme une évolution technologique importante pour trois raisons majeures :

  • Il n'existe pas d'iris confocal (sténopé) dans un microscope biphotonique. On ne peut donc plus parler de microscopie confocale, bien qu’on emploie quelquefois le terme de microscopie confocale multiphotonique de manière abusive.
  • L'utilisation d'une lumière d'excitation à une longueur d'onde élevée (> 900 nm) assure une plus grande pénétration à l'intérieur de l'échantillon (jusqu'à 500 µm au lieu de 150 µm) offrant la possibilité de travailler sur des échantillons plus épais.
  • L'excitation des fluorophores étant limitée au point de focalisation du faisceau laser, le risque de photoblanchiement est réduit.

En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70 µm d'épaisseur).

Cette technique est naturellement utilisée pour l'excitation simultanée de plusieurs fluorophores à spectres d'émission différents.

Une variante de cette technique est la microscopie à fluorescence par excitation multiphotonique multifocale. Le principe est identique, mais le faisceau laser est divisé en plusieurs faisceaux ce qui permet de balayer simultanément plusieurs points. Ceci permet de diminuer le temps d’acquisition des images.